クロマトグラフィーの基本原理
クロマトグラフィーとは、固定相（stationary phase）と移動相（mobile phase）への分配の違いを利用して、混合物を分離する分析法です。
🏃 旅人のたとえで覚える！
カラムの中を進む成分を「旅人」、固定相を「途中にある休憩所」と想像してください。
- 休憩所が大好きな旅人（固定相に引きつけられやすい）→ 何度も立ち寄って長居する → ゴール到着が遅い＝遅く溶出
- 休憩所が嫌いな旅人（固定相に引きつけられにくい）→ 素通りしてどんどん進む → ゴール到着が早い＝速く溶出
クロマトグラフィーの用語（国試必須）
| 用語 | 意味 |
|---|---|
| 保持時間（tR） | 試料注入から検出器でピークが現れるまでの時間 |
| 死時間（t0） | 固定相に保持されないピークの保持時間（カラムを素通りする成分） |
| 分離度（Rs） | 2つのピークがどれだけ分離しているかの指標。Rs ≥ 1.5で完全分離 |
| 理論段数（N） | カラム性能の指標。大きいほど分離能が高い |
| テーリング | ピークが非対称に尾を引く現象。固定相の不均一性が原因 |
① 分離モードの種類
クロマトグラフィーは分離の原理によって4種類に大別されます。
⚠️ サイズ排除（ゲル濾過）は逆！ 大きい分子はゲルの細孔に入れないため先に溶出し、小さい分子は細孔に入るため遅く溶出します。
② HPLC（高速液体クロマトグラフィー）★最頻出
HPLCは移動相として液体を使用するクロマトグラフィーです。医薬品の品質試験・定量分析で最も広く使われます。
逆相 vs 順相（超頻出）
国試の鉄則：逆相HPLCは「極性が低い（疎水性）ほど保持が強く、後に溶出」
③ 薄層クロマトグラフィー（TLC）
TLCは固定相（シリカゲル等）を塗布したプレートに試料を点着し、移動相（展開溶媒）で展開する方法です。
Rf値（国試頻出計算）
$$R_f = \frac{\text{試料の移動距離}}{\text{溶媒前線の移動距離}}$$
| Rf値の意味 | 内容 |
|---|---|
| 0 ≤ Rf ≤ 1 | 0（固定相に強く保持）〜1（素通り）の間 |
| Rf値 大きい | 固定相との親和性が弱い（順相では無極性化合物） |
| 同じRf値 | 同一化合物の可能性（≠確定。他の条件でも確認） |
| 温度・溶媒で変化 | 条件を統一しないとRf値は比較できない |
⚠️ 試験での注意：TLCは吸着クロマトグラフィー（順相）が基本！ 極性が大きい化合物ほどRf値が小さくなります。
④ ガスクロマトグラフィー（GC）
GCは**移動相として不活性ガス（ヘリウム・窒素・水素）**を使用します。試料は気化できることが条件です。
| 項目 | 内容 |
|---|---|
| 対象物質 | 揮発性のある化合物。沸点が低いほど分析しやすい |
| 分離原理 | 分配（固定液相への溶解度の差） |
| 特徴 | 高分解能・高感度。医薬品の残留溶媒試験（日局）に使用 |
| キャリアガス | He（ヘリウム）、N₂、H₂。不活性・試料と反応しない |
| 検出器 | FID（水素炎イオン化検出器）★最多 ／ TCD・ECD・MS |
GCは揮発性が必須条件！ 揮発しない・熱分解しやすい化合物には液体クロマトグラフィー（HPLC）を使う。
⑤ 検出器の種類と特徴
| 検出器 | 原理 | 対象化合物 | 感度・特徴 | 国試ポイント |
|---|---|---|---|---|
| UV検出器 | UV光の吸収（254nm・280nm） | 芳香環・不飽和結合を持つ物質 | 高感度・汎用。HPLCで最も多く使われる | DAD（ダイオードアレイ検出器）は全波長を同時測定★ |
| 蛍光検出器（FLD） | 励起光を当て、発する蛍光を測定 | 蛍光性物質・誘導体化後の物質 | UV検出器より高感度・高選択性 | アミノ酸・ビタミン・生体試料の微量分析 |
| RI検出器（示差屈折率） | 移動相との屈折率の差を測定 | ほぼ全物質（汎用） | 感度は低め。グラジエント溶出には使えない | UV吸収がない物質（糖質・高分子）に使う |
| MS（質量分析） | 質量電荷比（m/z）を測定 | ほぼ全物質（構造決定も可） | 感度・選択性ともに最高 | 構造未知の代謝物・不純物の同定。LC-MS・GC-MS |
⑥ その他のクロマトグラフィー
| 種類 | 原理 | 用途・特徴 |
|---|---|---|
| アフィニティー | 抗原-抗体・酵素-基質の特異的結合 | タンパク質・抗体医薬の精製。選択性が最も高い |
| イオン交換 | 荷電基への静電的引力 | アミノ酸・核酸の分析。陽イオン交換・陰イオン交換 |
| サイズ排除（GFC/GPC） | 分子サイズの差（ゲル細孔への出入り） | 大きい分子が先に溶出★。高分子量体分析 |
| 超臨界流体（SFC） | CO₂超臨界流体を移動相に使用 | 光学異性体分離・キラル分析 |
| キャピラリー電気泳動（CE） | 電荷・サイズの差による電気泳動 | アミノ酸・核酸・不純物分析。分離効率が非常に高い |
国試頻出まとめ
絶対に覚える6ポイント
| # | ポイント | 内容 |
|---|---|---|
| 1 | 逆相HPLCの溶出順序 | 極性↑ → 先に溶出、無極性↑ → 後に溶出 |
| 2 | サイズ排除の溶出順序 | 大きい分子 → 先に溶出（細孔に入れない） |
| 3 | GCの前提条件 | 揮発性が必要。不揮発性物質にはHPLC |
| 4 | Rf値の範囲 | 0〜1（0=完全保持、1=素通り） |
| 5 | UV検出器の弱点 | UV吸収がない物質（糖質等）には不向き → RI検出器 |
| 6 | 分離度Rs | Rs ≥ 1.5 で完全分離。Rs < 1.0 は分離不十分 |
日本薬局方（JP）でのクロマトグラフィーの位置づけ
| 分析法 | 日局での主な用途 |
|---|---|
| HPLC | 定量・純度試験（含量試験・不純物試験）。最も多用 |
| GC | 残留溶媒試験。揮発性不純物の確認 |
| TLC | 確認試験（同定）・純度試験（迅速・簡便） |
| イオン交換 | 無機イオン・アミノ酸の分析 |
製造工程で使用した有機溶媒の残留を確認するのが「残留溶媒試験」 → GCが使われる！